l02細(xì)胞復(fù)蘇的原則：快速融化：需要將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

　　（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：

　　1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃

　　2、用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

　　3.、在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等4、將RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、從4℃冰箱拿出5、配制適量含10%的胎牛血清及青蓮霉素混合液（1×）的*培養(yǎng)液放入4℃冰箱內(nèi)備用。

　?。ǘ┘?xì)胞復(fù)蘇：

　　1.取液氮中凍存細(xì)胞，于37C水浴鍋中不斷的搖動，使管中的液體在1min內(nèi)迅速融化，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，拿入超凈臺內(nèi)，將凍存管內(nèi)細(xì)胞吹打混勻后吸入10m1離心管內(nèi)，緩慢加入5-8ml含胎牛血清和青鏈霉素的*培養(yǎng)液。

　　2.離心機(jī)內(nèi)配平離心，1000r/min離心5min，吸棄上清液，將剩余細(xì)胞吹打混勻制成懸液轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入*培養(yǎng)液6ml，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%C02的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

　　l02細(xì)胞消化及傳代：

　　1.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。

　　2.小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS沖洗兩遍后，加入適量消化液（EDTA胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞：若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時(shí)細(xì)胞消化適度。

　　3.加入5ml培養(yǎng)液終止消化，用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。